kháng sinh đó; trong đó, những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào,
rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn
hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác
đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất
Hình 1. Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh
1.4. Đơn vị kháng sinh:
Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị
bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, µg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g,
International Unit
.
II. CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN
2.1. Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin
Penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928 do Alexander Fleming, khi nhận thấy một
hộp petri nuôi
Staphylococcus
bị nhiễm nấm mốc
Penicillium notatum
có xuất hiện hiện tượng
vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm.
Ông đã sử dụng ngay tên giống nấm
Penicillin
để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929).
Sau đó, Mỹ đã triển khai lên men thành công
penicillin
theo phương pháp lên men bề mặt (1931).
Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ
lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men
đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn
đề penicillin tạm thời bị lãng quên.
Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu khoa học đã công bố, Ernst Boris Chain quan
tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai
nghiên cứu này.
Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột.
Năm 1942, đã tuyển chọn được chủng công nghiệp
Penicillium chrysogenum NRRL 1951
(1943) và sau đó đã được biến chủng
P. chrysogenum Wis Q - 176
(chủng này được xem là
chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn thế giới ); đã
thành công trong việc điều chỉnh đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin
G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944)
Hình 2. Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 về công trình penicillin
Penicillin được xem là loại kháng sinh phổ rộng, được ứng dụng rộng rãi trong điều trị và
được sản xuất ra với lượng lớn nhất trong số các chất kháng sinh đã được biết hiện nay. Chúng
tác dụng lên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và thường được chỉ định điều trị trong các
trường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ như viêm màng não, viêm tai -
mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin được
ứng dụng điều trị rất hiệu quả. Tuy nhiên, chỉ vài năm sau đã xuất hiện các trường hợp kháng
thuốc và hiện tượng này ngày càng phổ biến hơn.
Vì vậy 1959, Batchelor và đồng nghiệp đã tách ra được axit 6-aminopenicillanic. Đây là
nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác nhau.
Đối với Việt Nam, năm 1946, giáo sư Đặng Văn Ngữ đã thành công trong việc sản xuất
nước lọc penicillin trong môi trường nước ngô góp phần đáng kể vào việc cứu chữa thương
bệnh binh và đã được Bác Hồ thưởng Huân chương Lao động hạng ba cho thành tựu kỳ diệu
chưa từng ai làm được này.
2.2. Công thức cấu tạo của penicillin
Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm một vòng
thiazolidine, một vòng β-lactam, một nhóm amino có gắn với CO
2
và một mạch bên (R).
Tất cả
các penicillin đều là dẫn suất của acid 6-aminopenicillanic. Sự thay thế R tạo nhiều acid amin
khác nhau. hầu hết các penicillin đều được phân phối dưới dạng muối natrii hoặc muối kali.
Hình 3. Cấu tạo chung của phân tử penicillin
Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra được trên 500 chế phẩm penicillin ( trong đó chỉ lên
men trực tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và tiếp tục triển khai để sản xuất các
chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác.
Hình 2: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum
2.3. Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc
2.3.1. Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P. chrysogenum
Vào những năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất
penicillin thường sử dụng các chủng có hoạt lực cao thuộc
loài
P. notatum và P. baculatum.
Nhưng từ khi trường đại
học Wisconsin (Mỹ)
phân lập được chủng
P.chrysogenum
có hoạt tính cao hơn thì chủng này dần dần đã thay thế và
từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX đến nay tất cả
các công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử dụng
các biến chủng
P.chrysogenum
công nghiệp.
Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản
xuất penicillin trên nguyên tắc cũng trải qua sáu giai đoạn
cơ bản đã mô tả trong mục 1.3.1, trong đó giải pháp kỹ
thuật đã được áp dụng hiệu quả để thu nhận biến chủng
"siêu tổng hợp" penicillin lại chính là các kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn -
ghen, xử lý tia cực tím và tạo đột biến bằng hoá chất, thí dụ như Metylbis - amin
(metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO
2
, Dimetylsulfat,
1,2,3,4 -diepoxybutan.
2.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum :
Theo quan điểm phổ biến hiện nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc
P.
chrysogenum
có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là
α-aminoadipic, cystein
và
valin
sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit
δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl
-
valin
;
tiếp theo là quá trình khép
mạch tạo vòng β-lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; rồi trao đổi nhóm
α-
aminoadipyl
với
phenylacetic
(hay
phenooxyacetic)
tạo thành sản phẩm penicillin G (hay
penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G trong hình.
Hình 3. Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-
α-
aminoadipic, L-cystein và L-valin
Tuy nhiên, cũng có thể nó được giải phóng ra và tích tụ trong môi trường (vì trong quá
trình lên men sản xuất penicillin V bao giờ cũng phát hiện thấy trong dịch lên men lượng lớn
α-
aminoadipic dạng vòng). Như vậy, quá trình sinh tổng hợp penicillin, phụ thuộc vào điều kiện
lên men cụ thể nhất định, có thể xảy ra theo sáu đường hướng khác nhau. Do đó, hiệu suất
chuyển hoá cơ chất - sản phẩm cũng biến đổi và phụ thuộc vào đường hướng sinh tổng hợp
tương ứng. Theo lý thuyết thì hiệu suất lên men sẽ trong khoảng 683 - 1544 UI penicillin/g
glucoza; song, trong thực tế, với những chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao nhất cũng mới chỉ
đạt khoảng 200 UI/g glucoza.
2.3.3. Tác động của các thông số công nghệ đến quá trình sinh tổng hợp penicillin.
2.3.3.1. Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm:
Sự phát triển hệ sợi nấm
trong quá trình lên men bao gồm:
-
Sự tăng trưởng về kích thước hệ sợi
(tăng độ dài sợi, sự lớn lên về kích thước, mức độ
phân nhánh của hệ sợi )
-
Sự biến thiên về số lượng khóm sợi nấm trong môi trường
: Thông thường, sự phát triển
này được đánh giá qua hai chỉ tiêu là: hàm lượng sinh khối và tốc độ biến thiên hàm lượng sinh
khối trong môi trường. Hai chỉ tiêu này có thể xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau
như: hàm lượng sinh khối (Sinh khối tươi hoặc sinh khối khô), mật độ quang dịch lên men, trở
lực lọc của dịch lên men, hàm lượng nitơ, hàm lượng hydratcacbon, hàm lượng axit nucleic
Trong các phương pháp trên, được áp dụng phổ biến hơn cả trong sản xuất công nghiệp là
phương pháp xác định qua hàm lượng sinh khối.
Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc hàng loạt các yếu tố khác nhau trong quá trình
lên men và sự tích tụ penicillin thường xảy ra mạnh mẽ khi hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân
bằng. Trạng thái này có thể xác lập được khi chỉ cung cấp vừa đủ và liên tục lượng thức ăn tối
thiểu cho nấm mốc. Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm sẽ tự phân, còn nếu cung cấp quá nhu cầu trên,
hệ sợi sẽ phát triển, nhưng không tích tụ mạnh penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic và axit
malic.
- Đặc điểm hình thái và cấu trúc hệ sợi nấm:
Trong quá trình lên men, do nhiều nguyên
nhân khác nhau, số lượng khóm sợi nấm bao giờ cũng có xu hướng tăng lên, ngay cả trong quá
trình lên men tĩnh. Trong điều kiện lên men có sục khí và khuấy trộn, do tác dụng va đập cơ
học với cánh khuấy và các chuyển động dòng xoáy trong môi trường, một mặt sự đứt gãy hệ
sợi nấm xảy ra nhiều hơn và hệ sợi nấm bao giờ cũng có xu hướng vón cuộn lại thành cấu trúc
búi sợi cuộn xoắn, được gọi là pellet.
Pellet xốp (fluffy loose pellets)
là dạng pellet có phần bên trong hệ sợi cuộn thành khối
chắc và mịn, lớp sợi phía bên ngoài cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp hơn.
Pellet chắc và mịn (compact smooth pellets)
có đặc điểm là phần sợi phía bên trong
pellet cuộn tương đối chặt chẽ ra đến gần sát lớp sợi phía ngoài, lớp sợi phía ngoài cùng cũng
cuộn đủ chắc thành lớp sợi mịn.
Pellet rỗng (hollow pellets)
là dạng pellet có phần sợi bên trong bị tự phân tạo thành
khoảng rỗng, hệ sợi phía bên ngoài cuộn rất chặt thành lớp sợi mịn và chắc chắn.
Hiệu quả chung của quá trình lên men có quan hệ hữu cơ với số lượng, kích thước và cấu
trúc pellet nấm. Trong thực tiễn sản xuất công nghiệp, người ta thường điều chỉnh các thông số
công nghệ theo hướng ưu tiên tạo ra dạng pellet đủ nhỏ và mịn, hạn chế tạo pellet xốp và ngăn
ngừa hình thành các pellet rỗng. Điều kiện công nghệ tương ứng với mục tiêu trên thường áp
dụng là : tỉ lệ cây giống 10%, với mật độ dịch giống (2-10).10
11
bào tử /m
3
; phối hợp điều chỉnh
giữa sục khí và khuấy trộn để đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với
thời điểm lên men, và để tạo ra pellet mịn và nhỏ (kích thước pellet thích hợp nhất khoảng 0,2 -
0,5mm), trong điều kiện đã cân đối với nhu cầu tiết kiệm mức tiêu tốn năng lượng do khuấy
trộn.
2.3.3.2. Đặc tính nhiệt động của dịch lên men:
Trong các thiết bị lên men
dung tích lớn có sục khí và khuất trộn, thực tế không thể xác
lập được sự đồng đều tại khắp các vùng thể tích làm việc của thiết bị. Tại các vùng chảy rối
(vùng gần cánh khuấy), tốc độ trao đổi nhiệt, tốc độ chuyển khối xảy ra mạnh mẽ hơn. Còn tại
các vùng chảy màng (vùng sát thành thiết bị, vùng gần các ống xoắn trao đổi nhiệt, vùng kém
hiệu quả hay vùng chết của thiết bị…) tốc độ chuyển khối hay tốc độ truyền nhiệt cũng giảm đi.
Ngoài ra, tại những khu vực nhất định của thiết bị có thể xuất hiện vùng xoáy cục bộ hay các
dòng chảy thứ cấp làm thiếu hụt về hàm lượng oxy hòa tan.
Các yếu tố nêu trên đây sẽ tác động trực tiếp đến năng lực sinh tổng hợp của chủng, hiệu
quả chuyển hóa tạo sản phẩm và hiệu quả kinh tế chung của toàn quá trình lên men. Thực tế
thường chọn chế độ khuấy trộn dư trên mức yêu cầu.
2.3.3.3. Thành phần môi trường lên men:
Môi trường cơ sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu trong những năm 40 - 50, là môi
trường lactoza - nước chiết ngô, với thành phần chính nêu trong bảng 2.1.
Nguồn cơ chất chính: là lactoza có thể được thay thế từng phần hoặc toàn bộ bằng các cơ
chất khác như: các loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit, dextrin hay thay thế bằng
dầu thực vật. Trong các cơ chất nêu trên, hiệu quả cao hơn cả vẫn là glucoza.
Ngoài ra, khi sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sử
dụng một phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính toán điều chỉnh nồng
độ glucoza trong môi trường lên men (và cả sự cản trở quá trình chuyển khối do ảnh hưởng của
dầu phá bọt).
Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: có thể sử dụng là bột đậu tương, bột hạt bông, các loại
dầu cám. Nhu cầu về thức ăn nitơ cũng có thể được đáp ứng bằng cách cung cấp liên tục
(NH
4
)
2
SO
4
, nhưng duy trì ở nồng độ thấp, khoảng 250 - 340g/l (nếu dư thừa hiệu quả sinh tổng
hợp penicillin sẽ giảm, nếu thiếu sẽ xảy ra hiện tượng tự phân hệ sợi) .
Hàm lượng các chất khoáng bổ sung: được tính toán, phụ thuộc vào lượng dịch chiết ngô
sử dụng;
pH môi trường được điều chỉnh trước khi thanh trùng, sau đó trong suốt quá trình lên
men được giám sát chặt chẽ và điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ.
Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong quá trình sinh tổng hợp penicillin, việc kết gắn mạch
nhánh của phân tử penicillin không mang tính đặc hiệu chặt chẽ. Nhờ vậy, nếu duy trì nồng độ
tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc phenooxyacetat) sẽ cho phép thu nhận chủ
yếu một loại penicillin G trong dịch lên men (hoặc penicillin V). Theo lý thuyết, nhu cầu về
phenylaceta là 0,47g/gam penicillin G (hoặc phenooxyacetat là 0,50g/gam penicillin V ). Cần chú
ý cả hai cấu tử trên thực chất đều gây độc cho nấm nên người ta thường lựa chọn giải pháp bổ
sung liên tục cấu tử này và khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu, để không làm suy giảm
năng lực lên men của chủng sản xuất.
2.3.3.4. Điều kiện tiến hành lên men:
Nhiệt độ
là thông số có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm mốc, khả năng sinh
tổng hợp và năng lực tích tụ penicillin của chúng. Nhìn chung nấm mốc phát triển thuận lợi hơn
ở dải nhiệt độ khoảng 30
0
C. Tuy nhiên, ở dải nhiệt độ này tốc độ phân huỷ penicillin cũng xảy ra
mạnh mẽ. Trong thực tế, ở giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân ở dải nhiệt độ
30
0
C; sang giai đoạn lên men thường áp dụng một trong hai chế độ nhiệt là :
Lên men ở một dải nhiệt độ: Thường duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình lên men ở dải
nhiệt độ 25 - 27
0
C.
Lên men ở hai chế độ nhiệt độ: Giai đoạn lên men bắt đầu tiến hành ở 30
0
C cho đến khi
hệ sợi phát triển đạt yêu cầu về hàm lượng sinh khối thì điều chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên
men penicillin ở dải nhiệt độ 22 - 25
0
C (có công nghệ điều chỉnh xuống 22 - 23
0
C, giữ ở nhiệt độ
này tiếp hai ngày rồi chuyển sang lên men tiếp ở 25
0
C cho đến khi kết thúc quá trình lên men).
pH môi trường
thuận lợi cho sự phát triển hệ sợi và cho quá trình sinh tổng hợp penicillin
thường dao động trong khoảng pH = 6,2 - 7,4. Tuy nhiên ở điều kiện pH cao xu hướng phân
huỷ penicillin cũng tăng lên. Vì vậy, trong sản xuất pH môi trường thường được khống chế chặt
chẽ ở giá trị lựa chọn trong khoảng pH = 6,2 - 6,8.
Nồng độ oxy hoà tan và cường độ khuấy trộn dịch lên men:
Với nhiều chủng nấm mốc,
nồng độ oxy hòa tan thuận lợi cho quá trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30%
nồng độ oxy bão hòa.
Nồng độ CO
2
trong dịch lên men
ở mức nhất định cũng cần thiết cho quá trình nảy mầm
của bào tử nấm mốc; tuy nhiên nếu nồng độ CO
2
quá cao sẽ làm cản trở quá trình hấp thu và
chuyển hoá cơ chất của chủng, nghĩa làm làm cản trở quá trình sinh tổng hợp penicillin.
2.3.3.5. Sự tích tụ và phân huỷ penicillin:
Trong quá trình lên men, do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó có ảnh hưởng của
nồng độ penicillin tích tụ trong môi trường ngày càng tăng, làm cho năng lực sinh tổng hợp
penicillin của chủng có xu hướng giảm dần theo thời gian lên men. Đồng thời, phụ thuộc vào
nhiệt và pH môi trường, một phần lượng penicillin đã tích tụ cũng bị phân huỷ theo thời gian.
Nhằm giảm tổn thất trên, ngay sau khi kết thúc quá trình lên men cần xử lý thu sản phẩm
sớm hoặc có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men.
III. QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT
3.1. Đặc điểm chung:
Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và
các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai, ngay mỗi bằng sáng chế thường cũng chỉ giới
hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra được công nghệ tổng quát chung.
Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn bộ dây chuyển sản xuất thuốc
kháng sinh penicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chính như sau (xem sơ đồ hình 2.8)
Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc penicillin G) .
Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên.
Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)
Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại
Hình 4. Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin
(theo Gist-Brocades Copr. (Hà Lan))
3.2. Chuẩn bị lên men
- Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất:
Giống dùng để lên men penicillin là P.chrysogenum, đây là loại nấm sợi bào tử hở. Khi mới phát
hiện trong môi trường đặc, chúng tạo ra hai dạng khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng
màu trắng. Sau khi nuôi cấy một ngày, khuẩn ty bắt đầu chuyển sang màu xanh xám và đính bào tử
bắt đầu xuất hiện. Thời gian này xuất hiện một ít bào tử trần từ tiền bào tử nằm trong các đính bào
tử. Các bào tử lần lượt được tạo thành theo thời gian nuôi cấy và cuối cùng thì màu của nấm
penicillium sẫm hơn.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét